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質粒抽提時,要做好充足的準備
點擊次數：591 發布時間：2020-05-13
質粒抽提偏大是如何判斷的？提取質粒后用通用引物做的PCR檢測嗎？如果是這樣的話偏大是正常的。你用特異性引物做ＰＣＲ檢測就不會出現偏大的問題。因為通用引物是根據質粒序列設計的，擴增出來的條帶除了含有你的目的序列外，還含有一段質粒上的序列，所以會偏大。
質粒是真核細胞細胞核外或原核生物擬核外能夠進行自主復制的遺傳單位，是細胞內的一種環狀的小分子DNA，作為一個具有自身復制起點的復制單位獨立于細胞的主染色體之外。質粒是分子生物學實驗中不可缺少的工具載體。高質量的質粒提取是下游試驗順利進行的可靠保證。
質粒抽提試劑盒選擇：
1、小提質粒：簡單快速，可高通量提取 ；（濃度）100-200ng/ul；（用途）測序，PCR，腺病毒包裝、多數細胞轉染實驗
2、中提質粒：質粒DNA量較高，（濃度）0.7-1ug/ul；（用途）測序，多數細胞轉染實驗
3、大提質粒：質粒DNA量非常高，雜質少，無內毒素（濃度）0.5-2ug/ul （用途）慢病毒、腺相關病毒包裝，多數細胞轉染或其他需要大量質粒的實驗大多數試劑盒都是在堿裂解法的基礎上優化改進的。
要提取高質量、高純度的質粒，必須做足夠的準備，如下：
1、提取質粒所必須的溶液的配制或者購買相關試劑盒。
2、宿主的選擇并制備高質量的感受態細胞。
3、培養基的選擇并配制好相關培養基。
4、提取質粒所需的工具，包括試管、離心機等的準備。
高質量的質粒在基因治療、疫苗和真核細胞轉染等實驗研究中是必要的。質粒抽提過程中，由于革蘭氏陰性細菌自溶或其他原因的破壞，會從其細胞壁上釋放出毒性脂多糖，稱內毒素。它會影響細胞轉染的效率；可以影響轉染過程中質粒DNA的吸收；也會激活免疫細胞中的非特異性免疫反應，干擾轉染結果，質粒的純度及內毒素含量很大程度上決定著著實驗的成敗。
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